Американські дослідники, які розробляють підходи до виправлення мутацій в гені дистрофіну за допомогою CRISPR, описали ще одну ефективну систему відновлення синтезу цього білка в м'язах модельних тварин. Для цього вчені розробили нову мишачу модель міодистрофії Дюшена. Згідно зі статтею, експресія дистрофіну в м "язах експериментальних мишей досягла 90 відсотків від норми.
Порушення синтезу білка дистрофіну в результаті вродженої мутації призводить до розвитку прогресуючої з віком міодистрофії Дюшена, яка веде до смерті хворого у віці 20-30 років. Шкідливі мутації зустрічаються в середньому в одного з 3600 хлопчиків.
Ген дистрофіна має складну структуру і складається з безлічі кодуючих шматочків - екзонів. Делеції в декількох з них призводять до появи в гені стоп-кодона і синтезу вкороченого нефункціонального білка. Дослідники з'ясували, що відновити синтез робочої версії дистрофіну можна, видаливши шматочок з мутацією за допомогою так званого «пропуску екзонів» (exon skipping). Оскільки краї екзонів містять ділянки впізнавання для білка Cas9 (PAM), вирізати мутантні екзони досить зручно за допомогою системи CRISPR-Cas9. Про те, як це працює, ми вже розповідали в іншій замітці.
Дослідники з університету Техасу під керівництвом Еріка Олсена (Eric Olson) раніше випробували підхід з CRISPR для вирізання 51 екзона в гені дистрофіна для усунення мутації, яка обумовлює 13 відсотків випадків захворювання. У новій роботі вчені зосередилися на іншому типі мутації - делеції в 44 екзоні гена. Ця мутація відповідає за 12 відсотків міодистрофії Дюшена у людей.
У попередньому випадку у вчених була можливість перевірити систему на собаках породи бігль, у яких зустрічаються випадки міодистрофії через загальну з людьми мутацію. Однак цього разу для перевірки ефективності видалення 44 екзона авторам роботи довелося створити нову модель міодистрофії і вивести мишей з відповідною делецією в геномі. Дистрофін у м'язах модельних тварин не детектувався.
Підбір направляючої РНК для вирізання 44 екзони здійснювали на стовбурових клітинах, узятих у пацієнта з міодистрофією Дюшена. З відредагованих клітин потім вирощували клітини серцевого м'яза. Вченим вдалося підібрати ефективну направляючу РНК на ділянку гена, який збігається у миші і у людини. Напрямну РНК і ген білка Cas9 вводили мишам у складі окремих вірусних векторів. Як і раніше, вчені використовували аденоасоційований вірус серотипу 9 (AAV9), який має найбільшу спорідненість до м'язів. Крім того, експресія CRISPR-Cas9 була обмежена тканеспецифічними регуляторними елементами.
Вірусні частинки вводили тваринам у м'яз або в кров. Виявилося, що при системній доставці (через кров) експресія робочої форми дистрофіну в серці досягає 80 відсотків від норми. Коли ж концентрацію вектора, що містить ген напрямної РНК, підвищили в 10 разів, кількість дистрофіну в серцевому м'язі склала вже 90 відсотків від норми. З цього експерименту дослідники зробили важливий висновок, що кількість направляючої РНК впливає на експресію Cas9 і лімітує ефективність редагування.
Незважаючи на високу ефективність терапії, отриману на мишах, вчені визнають, що для людини вона може бути набагато менше, оскільки людина набагато більше миші і ефективність редагування буде обмежуватися вже ефективністю вірусної доставки. Для єдиного схваленого на сьогоднішній день препарату, дія якого заснована на тому ж принципі пропуску екзонів (етеплірсен), ефективність вирізання становить менше одного відсотка.
Згадати, як працює система редагування CRISPR-Cas9, можна в ролику «Побачити CRISPR своїми очима».