Новий тест на SARS-CoV-2 на основі системи CRISPR/Cas обіцяє достовірний результат вже за п'ять хвилин. При цьому він визначає навіть десятки копій вірусної РНК у мікролітрі зразка і дає не тільки кількісну, а й якісну відповідь. Щоб домогтися такого результату, вчені використовували комплект з декількох направляючих РНК замість однієї, а в якості детектора сигналу пристосували камеру смартфона. Результати роботи попередньо опубліковані на порталі нерецензованих манускриптів medRxiv.
Незважаючи на те, що перші тести на SARS-CoV-2 з'явилися в лічені тижні після початку епідемії, вчасно виявити заражених людей досі складно. Проблема в тому, що тести повинні бути масовими і швидкими, оскільки частина людей, які можуть бути заразні, не мають симптомів або розвинуть їх тільки через кілька днів (ми писали про них в тексті «Невидима корона»), а концентрація вірусу в їх слині часто вже не відрізняється від такої у хворих COVID-19.
Найпоширеніший спосіб зловити вірус у мазку мокротиння - ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) в реальному часі (про нього ви можете прочитати в матеріалі «Корона в копиці сіна»). Принцип її роботи полягає в тому, що набір ферментів копіює кожну молекулу вірусної РНК і позначає її флуоресцентним барвником - і так відбувається до тих пір, поки світловий сигнал не стане достатньо сильним, щоб його розпізнав прилад.
Метод ПЛР популярний в основному за рахунок своєї чутливості - він дозволяє «побачити» одну-єдину копію РНК в мікролітрі зразка. Але у нього є свої недоліки: тест займає від декількох десятків хвилин до декількох годин, що з урахуванням логістичних труднощів перетворюється щонайменше на добу очікування результату, за які безсимптомний носій встигає поширити інфекцію далі.
Тому виник запит на більш швидкі тести, які не обов'язково повинні бути настільки чутливими: за даними клінічних досліджень, при концентрації РНК нижче тисячі копій на мікролітр кількість вірусних частинок в мазку вже не настільки істотно і не представляє великої небезпеки. Одним з альтернативних методів, який міг би дозволити прискорити тестування, стала система CRISPR/Cas (та сама, за яку нещодавно присудили Нобелівську премію з хімії).
Для пошуку SARS-CoV-2 цю систему пристосували ще навесні, і працювало це приблизно так: з мазка пацієнта швидко екстрагують РНК і кілька разів копіюють цілком. Потім додають направляючу РНК, комплементарну до послідовностей вірусу. Ця РНК пов'язується з вірусним геномом і активує фермент групи Cas, який починає різати вірусну РНК - а заодно і всі молекули одноланцюжкової РНК, з якими зустрічається. Якщо додати до розчину молекулу РНК, пов'язану з барвником, то при розщепленні він буде вивільнятися і подавати колірний сигнал про те, що вірус у пробі виявлений.
Вся ця процедура займала близько години - що вже швидше, ніж ПЛР в реальному часі, але ще недостатньо швидко для масових тестувань, а головне - вимагає складного обладнання і реагентів. Тому група вчених з Каліфорнійського університету під керівництвом нобелівського лауреата Дженніфер Дудни (Jennifer Doudna) зайнялася розробкою ще більш швидкого і просто тесту на SARS-CoV-2.
Дослідники створили десяток направляючих РНК (всі вони були комплементарні до різних ділянок вірусного геному) і відібрали з них найбільш ефективно працюючу пару. Система, в якій направляючих РНК стало дві, дозволила відразу вирішити кілька проблем.
По-перше, кожна копія вірусної РНК запускає роботу не одного ферменту Cas13a, а відразу декількох. А це, своєю чергою, дозволяє обійтися без попереднього копіювання всієї РНК у зразку - сигнал і так виявляється досить сильним. У повній версії новий тест займає півгодини, але вже по перших п'яти хвилинах спостереження вченим вдалося однозначно визначити, які зразки позитивні, а які негативні.
По-друге, тепер тест-система працює ще точніше і не реагує на РНК інших вірусів: дослідники перевірили її на декількох споріднених SARS-CoV-2 коронавірусах (у тому числі MERS) і не отримали сигналу. Чутливість при цьому залишилася прийнятною - близько сотні вірусних РНК на мікролітр. Коли ж вчені спробували додати в систему третю направляючу РНК, то чутливість виявилася ще вищою - до 31 копії на мікролітр.
По-третє, тепер тест дозволяє оцінити не тільки наявність, а й кількість вірусної РНК. Оскільки з методу зник етап копіювання РНК, то число копій РНК у зразку не змінюється, і про нього можна судити за інтенсивністю сигналу. Дослідники вважають, що така технологія могла б допомогти відстежувати розвиток хвороби в окремих пацієнтів.
Нарешті, в якості детектора вчені використовували камеру смартфона, на основі якої сконструювали лазерний флуоресцентний мікроскоп, додавши джерело лазерного променя і фільтр. Виявилося, що чутливості камери достатньо, щоб обійтися без громіздких приладів і розрізняти сигнали різної інтенсивності зі зразка.
Нова система поки працює тільки в лабораторних умовах, проте Дженніфер Дудна розповіла журналу, що її колеги шукають спосіб вийти зі своїм винаходом на ринок. Вони вважають, що їх метод ще довгий час буде залишатися актуальним: навіть якщо вакцина від коронавірусу з'явиться в найближчі місяці, поки немає ніякої гарантії, що викликана їй імунна відповідь виявиться довгостроковою - а значить, залишиться потреба в масовому тестуванні, щоб відстежувати локальні спалахи інфекції.
Всі матеріали про пандемію COVID-19 ми публікуємо в рубриці «Коронавірусні хроніки». Там ви можете почитати про те, навіщо тестувати тих, хто вже перехворів, і як працює ще один експрес-тест (правда, він вимірює концентрацію антитіл до вірусу) на основі графенового сенсора.