Молекулярні біологи з Університету Каліфорнії в Сан Дієго (США) на основі технології CRISPR/Cas9 розробили метод усунення транскрипів «паразитної» РНК. Накопичення такої РНК пов'язане з розвитком безлічі важких захворювань, таких як бічний аміотрофічний склероз, міотонічна дистрофія м'язів, хвороба Хантігтона тощо. Вченим вдалося випробувати новий метод поки тільки на окремих клітинних лініях, проте результати досліджень виглядають досить перспективно з точки зору терапії цих досі невиліковних захворювань. Стаття дослідників опублікована в журналі.
Мікросателіти - це ділянки генома, що представляють собою множинні повтори коротких (менше 9 букв) нуклеотидних «фраз», на кшталт (CTG) n, (CCTG) n тощо. Вони складають значну частину всього геному людини і часто розглядаються в якості так званої сміттєвої, тобто не виконує ніяких осмислених функцій ДНК. Подібні повтори зустрічаються як поза, так і всередині генів (насамперед у некодуючих ділянках, інтронах), вони мають тенденцію швидко змінюватися (збільшуватися або зменшуватися) від покоління до покоління, що, наприклад, використовується в генетиці для встановлення споріднення між близькими індивідами.
Експансію таких послідовностей, якщо вони знаходяться всередині генів, медики пов'язують з розвитком декількох важких захворювань. Мабуть, збільшення числа повторів у ДНК шкідливе не саме по собі, а як причина неправильного дозрівання (сплайсингу) матричної РНК цих генів. Розвиток захворювання зазвичай супроводжується накопиченням в ядрі точкових агрегатів РНК з цими «сміттєвими» послідовностями. Іноді така РНК навіть транслюється в білки, що призводить до накопичення нерозчинних білкових агрегатів і призводить до загибелі клітин. На рівні організму це виглядає як незворотна дистрофія м'язів, відмирання периферичних нейронів і так далі.
Причинно-наслідковий зв'язок між накопиченням мікросателітів в генах і розвитком тих чи інших симптомів хвороби поки досліджена слабо і знаходиться для більшості обговорюваних хвороб на рівні доведеної кореляції. У разі одного з типів бічного аміотрофічного склерозу докладніше можна почитати тут, у разі міодистрофіії - тут і тут, про хворобу Гантінгтона - тут. Тим не менш, є підстави вважати, що оскільки кожне із захворювань супроводжується накопиченням агрегатів РНК в ядрах, то і усунення цих агрегатів може призвести до усунення симптомів захворювання. Саме цим керувалися автори нової статті, які розробили метод усунення агрегатів і «вилікували» з його допомогою кілька клітинних культур.
Теоретично, усунути причину обговорюваних захворювань можна було б за допомогою точкового втручання в геном: достатньо видалити повтори, привести потрібні гени в «нормальний» стан і причина хвороби буде ліквідована. Вдосконалення технології CRISPR/Cas9 (про те, що це, можна почитати тут) зробило цю теоретичну можливість практичною опцією терапії. У деяких випадках такий підхід вже навіть вийшов на стадію клінічних досліджень.
Проблема в тому, що редагування генома передбачає розрізання ДНК, а це загрожує різким збільшенням кількості мутацій у клітинах. Крім того, застосування навіть найточніших «геномих ножиць» неминуче призводить до виникнення зайвих, нецільових (off-target) розрізів в інших місцях геному, що також небезпечно і може супроводжуватися розвитком злоякісних новоутворень. Обговорення масштабу таких нецільових розривів при генетичній терапії зараз знаходиться в самому розпалі, і, можливо, в реальності небезпека CRISPR/Cas9 сильно перебільшена. Як би там не було, перехід від ДНК до РНК дозволяє усунути цю проблему повністю: які б побічні розриви не відбувалися в РНК, вони не позначаться на стабільності геному. Далеко не для всіх хвороб такий перехід можливий, проте саме тому автори нової статті звернули свою увагу на ті захворювання, що пов'язані з накопиченням мікросателітної РНК.
Працює новий метод наступним чином: У клітини за допомогою модифікованого аденовірусу вноситься генетичний конструкт, який містить напрямну РНК і спеціалізовану версію нуклеази Cas9. Остання не здатна розрізати ДНК, оскільки в її активному центрі штучно видалені необхідні для цього амінокислоти. Тим не менш, інактивована нуклеаза може зв'язуватися з молекулами РНК під керівництвом відповідної направляючої РНК. До модифікованої Cas9, названої авторами RCas9, також приєднана коротка РНКаза, яка знищує ті РНК, до яких приєднується комплекс.
В ході експериментів на клітинних лініях, в т. ч. і виділених у пацієнтах з міодистрофією, вчені показали, що RCas9 дійсно здатна усувати агрегати специфічної для захворювання мікросателітної РНК. Крім того, в клітинах відбуватися нормалізація зміненого при дистрофії сплайсингу (на рівні всього геному, а не окремого гена з мікросателітами) і різко падає концентрація кількість пептидів, трансльованих з мікросателітних повторів. Що стосується побічних ефектів, то автори оцінили вплив системи на нецільові РНК як незначний: за даними транскриптомного аналізу, менше 10 різних генів змінили свій рівень експресії в результаті застосування RCas9. Окрема частина статті присвячена експериментам зі зменшення розміру Cas9 таким чином, щоб отриманий конструкт можна було помістити в дуже обмежений геном вірусу-носія.
Технологія редагування генома CRISPR/Cas9 останнім часом поступово приходить у клінічну практику. Поки більшість вчених не ризикує застосовувати її для внесення перманентних, успадкованих змін в геном, хоча лабораторні експерименти в цьому напрямку проводяться вже не тільки в Китаї, але і в США. Більшість методів терапії зосереджено на внесенні ненаслідованих змін до соматичних клітин або на ще більш м'якій версії методу - дії на рівні РНК. Докладніше про те, які системи CRISPR взагалі існують і як їх досліджують можна прочитати тут.