Вчені з Португалії створили бактеріофаги з укороченим геномом і описали їх. Це перша успішна спроба створити синтетичні бактеріальні віруси. Автори сподіваються, що їх дослідження допоможе при створенні нових антибактеріальних речовин. Робота опублікована в.
Антибіотикостійкість у всьому світі - це одна з найстрашніших загроз здоров'ю людства. Вона змушує дослідників шукати альтернативні терапевтичні підходи. У тому числі, вчені розглядають використання бактеріофагів - вірусів, які заражають бактерії. Ідея сама по собі не нова: використовувати бактеріофаги в якості ліків починали ще в 1920-х, коли антибіотики ще не були доступні. Відтоді бактеріофаги - як і природні, так і змінені генно-інженерними способами - використовувалися як терапія (про один з таких випадків редакція розповідала минулого року), але так і не стали повноцінним замінником антибіотиків. Ситуація складається таким чином з багатьох причин, і в тому числі через недостатню вивченість багатьох фагів.
Геноми бактеріофагів невеликі, однак і в них зустрічаються ділянки (досить великі, до 80 відсотків геному), функції яких вченим поки невідомі. Є певна ймовірність, що білки, кодовані невідомими генами, можуть бути шкідливими для людини. Крім того, «цілі» геноми незручні для подальшого маніпулювання, наприклад, додавання необхідних для терапевтичних цілей генів. Видалення генів з невідомими функціями дозволило б залишити тільки відомі і безпечні гени і звільнити місце для нових.
Подібні досліди з мінімізування геномів вже проводилися на живих об'єктах. Популярність отримали роботи, виконані під керівництвом біолога Крейга Вейнтера (J. Craig Venter) зі створення бактерії з мінімальним геномом. Тоді вчені визначили частину генів бактерії як «не життєво необхідні» і видалили їх, отримавши, по суті, новий синтетичний організм. Детальніше про цей напрямок у синтетичній біології можна прочитати в матеріалі «Прожитковий мінімум».
У новій роботі португальські вчені прагнули створити синтетичний бактеріофаг, який вражав би синегнойну паличку (). На даний момент лікування викликаних інфекцій досить ускладнене через високу стійкість цієї бактерії до багатьох антибіотиків. ВООЗ називає розробку засобів проти синьогійної палички одним із пріоритетних завдань.
Дослідники з університету Мінью під керівництвом Жуани Азередо (Joana Azeredo) взяли за основу бактеріофаг, що вражає Р, який вони виділили зі стічних вод. Для початку вчені перевірили природні здібності цього фагу (він отримав назву РЕ3). З 28 отриманих від пацієнтів зразків бактеріофаг зміг вразити сім. Дослідники отримали зображення бактеріофагу за допомогою просвічувальної електронної мікроскопії, і провели секвенування його геному. З'ясувалося, що геном фагу PE3 складається з 43,5 тисяч нуклеотидних підстав дволіпочкової ДНК. Спираючись на результати комп'ютерного аналізу, дослідники припустили, що всього в геномі 55 кодуючих білки послідовностей. Автори роботи зробили висновок, що описаний ними бактеріофаг відноситься до сім'ї.
Далі вчені припустили, що з геному бактеріофагу PE3 можна вирізати два модулі генів, які, ймовірно, кодують білки: з першого по п'ятий (gp1-gp5) і з шостого по дванадцятий (gp6-gp12). Автори роботи створили три варіанти синтетичного геному: у двох видалили по одному з додатків, і в третьому видалили обидва. За допомогою ПЛР дослідники ампліфікували гени, що залишилися, і з'єднали їх у клітинах дріжджів у штучну дріжджову хромосому. Отриманий синтетичний геном бактеріофагу виділили з дріжджів і трансформували ними бактерію-господаря, щоб перевірити здатність спадкової інформації фагу геному запустити програму складання вірусних частинок. Експеримент пройшов успішно: на чашках з бактеріями утворилися видимі фагові бляшки - місця, де вірус пошкодив бактерії.
Щоб краще зрозуміти, як нокаут генів вплинув на бактеріофаг, автори роботи порівняли його життєздатність з диким типом. По-перше, фагові бляшки зменшилися в розмірах.
По-друге, не всі синтетичні бактеріофаги змогли інфікувати ті ж штами синьогнійної палички, що і їх попередник. Тільки фаги з делецією модуля gp6-gp12 надали значний ефект на 7 з 28 клінічних зразків P. aeruginosa, інші інфікували лише 4 штами. Крім того, фаги з делецією gp6-gp12 демонстрували темпи зростання, схожі з РЕ3, в той час як фаги з делеціями gp1-gp5 і gp1-gp12 відставали на п'ять і п'ятнадцять хвилин, відповідно.
У той же час, антибактеріальна ефективність бактеріофагів не постраждала від проведених маніпуляцій. Це з'ясувалося під час експериментів, де до бактеріальних культур, що знаходяться в експоненціальній фазі росту, додали бактеріофаги. Співвідношення вірусних частинок до клітин склало 1:5. Всі варіанти фагів виявили однакову ефективність, значних відмінностей не спостерігалося (р > 0,01). Через дві години після додавання фагів кількість живих клітин зменшилася на п'ять порядків у всіх зразках порівняно з контрольною групою (р < 0,01). Після цього, однак, кількість живих клітин знову стала зростати, і через 24 години після початку експерименту майже не відрізнялася від контрольної групи (р < 0,01). Це демонструє швидкий розвиток нечутливих до фаг мутантних бактерій.
Також дослідники протестували терапевтичну ефективність синтетичних бактеріофагів на Великій восковій молі (). Після інфікування бактеріями, комахам ввели розчини з бактеріофагами. Через 24, 48 і 72 години виживаність в контрольній групі склала, відповідно, 20, 13 і 10 відсотків. Група, що отримала лікування бактеріофагами, продемонструвала кращі результати (р < 0,05): їх виживаність склала 50 відсотків через 24 години, і 30 відсотків через дві і три доби. При цьому зі своїм завданням однаково добре впоралися і синтетичні бактеріофаги, і їх природний попередник.
Вчені сподіваються, що методи синтетичної біології надалі дозволять швидко розробляти і створювати спеціалізовані бактеріофаги до багатьох бактеріальних видів.
Бактеріофаги і раніше вже допомагали медикам: так, спільне застосування фагів і антибіотиків врятувало пацієнта від антибіотикостійкої інфекції, а модифіковані фаги, можливо, вилікували інфекцію мікоплазмою. Крім того, австралійські вчені описали, як присутність бактеріофагів змушує бактерію знову стати чутливими до антибіотиків.